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Western及IP裂解液的使用方法及注意事項

更新時間:2025-08-21      點擊次數:263
Western 及 IP 裂解液的使用方法與實驗結果的準確性和可靠性緊密相關,規范操作并注意關鍵細節,才能充分發揮其性能。下面從使用方法和注意事項兩方面為你詳細介紹:

一、Western 及 IP 裂解液的使用方法

  1. 實驗前準備

    • 樣本收集:根據實驗需求收集細胞或組織樣本。對于細胞樣本,貼壁細胞需先用 PBS 緩沖液輕柔洗滌 2 - 3 次,去除培養基殘留;懸浮細胞則通過離心(通常 500 - 1000 rpm,3 - 5 分鐘)收集,并用 PBS 重懸洗滌。組織樣本需在預冷的生理鹽水中清洗,去除血液等雜質,并用干凈的剪刀或刀片將其剪碎成小塊。

    • 裂解液準備:從低溫儲存環境(-20℃或 4℃,根據產品說明)取出裂解液,平衡至室溫。若裂解液中蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑等為單獨包裝,需在使用前按照說明準確添加到裂解液中,并充分混勻。

  2. 樣本裂解

    • 細胞樣本裂解:對于貼壁細胞,可直接在培養板中加入適量裂解液(通常每 1×10?個細胞加入 100 - 200 μL 裂解液),輕輕搖晃培養板使裂解液均勻覆蓋細胞表面,然后置于冰上,通過溫和振蕩(如渦旋振蕩器,低速振蕩 1 - 2 分鐘)或超聲處理(30 秒超聲,間隔 30 秒,重復 3 - 5 次,超聲功率需根據細胞類型調整)進行裂解。懸浮細胞則需先離心去除 PBS,再加入裂解液,同樣在冰上進行振蕩或超聲處理。

    • 組織樣本裂解:將剪碎的組織樣本轉移至預冷的勻漿器或離心管中,按照每 100 mg 組織加入 500 - 1000 μL 裂解液的比例添加裂解液。先使用機械勻漿器進行初步勻漿,使組織破碎,然后結合超聲處理進一步裂解細胞,確保蛋白質充分釋放。

  3. 蛋白質提取

    • 靜置與離心:樣本裂解完成后,將其置于冰上靜置 5 - 10 分鐘,使裂解更充分。隨后,將裂解物轉移至離心管中,在 4℃條件下,以 12000 - 15000 rpm 離心 10 - 15 分鐘,使細胞碎片、不溶性物質沉淀于管底,而上清液即為含有蛋白質的裂解產物。

    • 收集上清:小心吸取上清液至新的離心管中,避免吸入沉淀。若后續實驗對蛋白質濃度要求較高,可對上清液進行適當濃縮處理,如使用超濾管進行濃縮。

二、使用 Western 及 IP 裂解液的注意事項

  1. 裂解液儲存與保質期

    • 儲存條件:裂解液應嚴格按照產品說明進行儲存,多數需在 - 20℃低溫保存,避免反復凍融,因為多次凍融可能導致蛋白酶抑制劑等成分失活,影響裂解效果。若裂解液含有對溫度敏感的特殊成分,可能需要在 4℃保存。

    • 保質期檢查:使用前需檢查裂解液的保質期,過期的裂解液可能因成分降解而無法有效裂解細胞或保護蛋白質,從而影響實驗結果。若裂解液出現渾濁、沉淀或顏色異常等情況,應避免使用。

  2. 操作過程中的細節把控

    • 低溫操作:整個樣本裂解和處理過程應盡量在冰上或 4℃環境中進行,以降低細胞內蛋白酶的活性,減少蛋白質的降解。特別是對于一些不穩定或易降解的蛋白質,低溫操作尤為重要。

    • 避免交叉污染:使用無菌的移液器槍頭、離心管等實驗器具,避免不同樣本之間的交叉污染。同時,在添加裂解液、吸取上清等操作時,要小心謹慎,防止液體濺出污染其他樣本或實驗環境。

    • 裂解條件優化:不同的細胞類型和組織樣本對裂解條件的要求可能不同,需根據實際情況優化裂解時間、超聲功率、振蕩強度等參數。例如,對于一些細胞壁較厚的植物細胞或堅韌的組織樣本,可能需要適當延長裂解時間或提高超聲功率,但也要避免過度裂解導致蛋白質結構破壞。

  3. 與后續實驗的兼容性

    • 成分兼容性:確保裂解液中的成分不會對后續實驗產生干擾。例如,若后續要進行蛋白質純化(如親和層析、離子交換層析),裂解液中的高濃度鹽、去垢劑等成分可能影響純化效果,需進行適當的透析、稀釋或更換緩沖液等處理。若進行質譜分析,需注意裂解液中的某些添加劑可能會影響質譜檢測,應選擇質譜兼容的裂解液或進行樣品預處理。

    • 實驗體系匹配:根據后續實驗目的選擇合適的裂解液。若進行 Western Blot 實驗,需保證裂解液能夠使蛋白質充分變性;若進行 IP 實驗,則要選擇能夠保持蛋白質天然構象的溫和型裂解液,以確保蛋白質 - 蛋白質相互作用不被破壞。



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